重组大熊猫白介素2和6及其融合蛋白在小鼠模型中对犬瘟热重组疫苗的佐剂效应研究
2024-10-31 11:00 浏览:130
大熊猫被誉为中国的“国宝”,是世界级珍稀野生动物,然而它却濒临灭绝,除了人为原因对大熊猫栖息地的破坏以外,疾病死亡成为当前大熊猫种群濒危的关键原因之一。在大熊猫所患的40多种疾病中,犬瘟热是威胁大熊猫种群数量和生命安全的首要烈性传染病。疫苗免疫目前是预防控制CDV的主要措施,但当前使用的疫苗并不十分理想,存在免疫效率低与安全性差两大难题。因此,在安全剂量疫苗接种下提高大熊猫机体的免疫力,成为当今疫苗开发研究的焦点。细胞因子是由免疫效应细胞和其他相关细胞产生,具有多种生物学活性。在免疫应答的产生和调节中具有重要作用。白细胞介素2和6是白细胞介素家族中的重要成员,其被作为免疫佐剂增强疫苗免疫效果的报道屡见不鲜。 鉴于此,本研究以大熊猫白细胞介素2(IL-2)和大熊猫白细胞介素6(IL-6)为研究对象,开展了重组大熊猫白介素2和6及其融合蛋白在小鼠模型中对犬瘟热重组疫苗的佐剂效应研究,主要研究内容包括： 1.本研究运用反转录PCR技术,从刀豆蛋白诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增出大熊猫IL-2和IL-6基因,并将其亚克隆到PMD18-T载体中。经双酶切鉴定和序列测定后,运用生物信息学软件对目的基因进行序列分析显示,克隆得到的IL-2基因由468个碱基组成,编码155个氨基酸组成的多肽,由20个氨基酸的信号肽和135个氨基酸的成熟肽组成,分子质量为17.92kDa。将IL-2的氨基酸序列与Genbank中的人、犬、猫、小鼠、艾鼬等物种进行同源性比对发现,其同源性在44%～90.4%之间不等。IL-6基因全长为636bp,编码211个氨基酸残基,包括25个氨基酸的信号肽和186个氨基酸的成熟肽,分子量为23.67kDa。与Genbank中其他物种的氨基酸序列进行同源性比对发现,其同源性在34.9%-77.9%之间。构建IL-2、IL-6的系统进化树发现大熊猫均与艾鼬的亲缘关系最近。 2.将克隆的成熟肽大熊猫IL-2和IL-6基因以及构建的融合基因IL-6/2亚克隆到原核表达载体PET-32a(+)上,构建重组表达载体PET-32a(+)-2、PET-32a(+)-6、 PET-32a(+)-6/2。将酶切鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明,分别在相对分子质量约为35kD,41kD和57kD处有明显的蛋白质表达条带,用纯化的重组蛋白进行兔抗IL-2、IL-6多克隆抗体制备,其抗体效价分别为1:4和1:8。Western blot表明制备的抗血清能特异性的产生蛋白质反应。融合蛋白经过纯化和复性后,用MTT法检测其生物学活性,结果表明所获得的重组蛋白均具有较高的促小鼠外周血淋巴细胞增殖反应的活性。 3.将CDV疫苗与佐剂因子混合注射小鼠后,于7、14、21、28、35、42d尾静脉采集小鼠血清,通过ELISA方法检测不同免疫组所产生的抗CDV抗体水平,以及血清中IL-4、IFN-γ的水平,结果发现,IL-2在体液免疫和细胞免疫方面都对CDV疫苗具有很好的免疫增强效应。表现为CDV+IL2试验组均显著高于CDV+PBS对照组。CDV+IL6免疫组与CDV+IL6/2组在CDV抗体产生和细胞因子分泌水平上普遍比CDV+PBS对照组略高,但未表现出明显的佐剂效应。